Debido a que las mutaciones HbS y HbC
están separadas por un solo nucleótido, no es fácil desarrollar sondas
específicas para PCR en tiempo real, por lo que se describe una técnica de
pirosecuenciación (PyS) que se desarrolló para confirmar el genotipo SCD. La
técnica se validó usando la secuenciación de Sanger del gen HBB.
Pirosecuenciación: La técnica de pirosecuenciación es una herramienta altamente confiable para la determinación de pequeñas regiones dentro de los genes de la globina, y tiene la ventaja de ser una técnica relativamente simple. Además es más rápida y se asocia con un menor costo de operación en comparación con otras metodologías de secuenciación. Las secuencias de cebadores se diseñan
utilizando de la siguiente manera:
Adelante 5’ATTGCTTACATTTGCTTCTGACAC3’, Inversa 5’ACCAACTTCATCCACGTTCAC3. La PCR se
realizó utiliza 100 ng / μL de ADN de
acuerdo con el protocolo y el producto usando la secuencia de cebador 5'CATGGTGCATCTGACT3 '.
Secuenciación Sanger: Utiliza la técnica de secuenciación
de Sanger para la determinación de mutaciones de talasemia β. La PCR se utilizó
para amplificar un fragmento de 101 pares de bases que cubren la región de
codificación del gen Beta Globin, que tiene aproximadamente 619 pares de bases,
utilizando la siguiente secuencia de cebadores: (P1)
5’-TCCTAAGCCAGTGCCAGAAG-3’y el cebador aguas abajo (P5)
5’-TCATTCGTCTGTTTCCCATTC3’.
Referencias Bibliográficas:
